虽然细胞肿瘤抗原p53大约在三十年前被发现，但仍然与癌症研究领域中的大多数成果有关(Kruse and Gu, 2009; Lu et al., 2009)。细胞肿瘤抗原p53或p53是由TP53基因编码的蛋白质，其是肿瘤抑制基因最重要的。该基因在除了某些鱼类之外的人类和哺乳动物中得到了很好的研究。它也称为肿瘤抑制物p53、磷酸蛋白p53、抗原NY-CO-13、p53、转化相关蛋白53(TRP53)，其在细胞凋亡中起重要作用，如在肿瘤发育和基因组稳定性中的程序性细胞死亡(Kruse and Gu, 2009; Storer and Zon, 2010)。

肿瘤抑制基因p53蛋白作为一个转录因子，在其相互作用网络中控制许多基因的表达，其由上游调节子和下游靶基因组成(Fields and Jang, 1990)。在细胞和个体水平上p53具有抑制肿瘤发生和保护个体的能力。P53是一种位点特异性DNA结合蛋白(Kern et al., 1991)，其在其网络中反式激活基因(Fields and Jang, 1990; Lu et al., 2007)。因此，如果p53突变，则可导致肿瘤形成。p53的活性和表达通过多层调节来监测，主要是通过泛素连接酶，如翻译后水平上的Mdm2和Mdm4(Le et al., 2009)。Mdm2蛋白结合p53并使其失活。Mdm2是一种E3泛素连接酶，其在活性p53的形成中上调，其中多泛素化肿瘤抑制剂p53用于蛋白酶体靶向(Oren, 1999)。据报道，由于mdm2吗啉代的脱靶效应(Robu et al., 2007)，mdm2缺陷型斑马鱼胚胎显示生长阻滞和高水平的凋亡(Storer and Zon, 2010)。在哺乳动物中，p53的稳定性和功能由许多翻译后修饰调节，而在斑马鱼中，调节mRNA和蛋白质的水平响应于不同类型的应激已经被证实(Brooks and Gu, 2003; Langheinrich et al., 2002; Storer and Zon, 2010)。p53基因的突变将使其肿瘤抑制机制和其它因素失活，这将导致肿瘤形成。单个氨基取代也将影响p53的表达(Petitjean et al., 2007)。在小鼠模型中已经充分研究了由于突变导致的p53功能丧失(Leng et al., 2003; Olive et al., 2004)。因此，其功能受到翻译后调节以及相互作用的p53结合蛋白的调节，例如p53的mdm2和E3泛素连接酶。

在本研究中，我们已经使用生物信息学工具来比较分析九个不同鱼的细胞肿瘤抗原p53蛋白序列。我们已经探索了肿瘤抑制p53基因及其蛋白质序列在鱼之间的机制，因为已有很多学者对人类和哺乳动物的p53进行了研究，但关于鱼类的研究却鲜见报道。在最近的生物信息学时代，已经开发了几种工具和算法来理解原子水平的生物分子和预测潜在的机制。进一步了解使用细胞机制与蛋白质修饰鱼类中的肿瘤抑制p53调控将有助于了解调节p53组织特异性反应的体内基本机制。

1材料与方法

我们已使用不同的生物信息学工具来研究具有特定目的的肿瘤抑制因子p53蛋白质。

1.1数据收集

UniProt是容易获得的蛋白质序列数据库(http://www.uniprot.org/)。 我们从九种不同的鱼中检索了总共九种蛋白质序列用于我们的研究(表1)。我们已经检索了FASTA格式的蛋白质序列。

1.2理化表征

ProtParam(http://web.expasy.org/protoparam/)是expasy工具，其用于基于序列计算给定蛋白质的物理和化学参数。我们使用ProtParam工具计算了九个检索蛋白质序列的几种物理化学性质，如理论等电点(pI)、分子量、正负残基总数、消光系数、半衰期、不稳定性指数、脂肪指数和总平均亲水性(GRAVY)。

1.3比对和系统发育研究

为了研究不同蛋白质序列之间的比较，我们使用全局多序列比对(MSA)程序分析来自不同鱼类的p53蛋白质序列。目前，多序列比对(MSA)方法被广泛用于评估蛋白质研究中的序列保守性和蛋白质结构域保守性。 在此步骤中，使用Clustal Omega (Sievers et al., 2011)工具进行MSA分析。为了解不同蛋白质序列之间的系统发育关系，我们通过分类图描绘了这些序列的进化关系。 Prosite，ScanProsite(de Castro et al., 2006)工具用于鉴定预测图案命中的编号。(http://prosite.expasy.org/ scanprosite /)。

1.4基因本体和蛋白质-蛋白质相互作用网络的分析

我们进一步研究了使用Uniprot鉴定的p53的生物学和分子功能基因本体论(http://www.uniprot.org/)。使用STRING (Franceschini et al., 2013)(用于检索相互作用蛋白的搜索工具)来研究p53(http://string-db.org/)的蛋白质-蛋白质相互作用网络。

1.5三维结构分析和分子对接

基于同源结构模型，利用同源建模构建p53三维模型。通过使用针对PDB数据库中可用的3D结构的PSI-BLAST(NCBI, http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast)来鉴定与我们的靶模板具有最高序列同源性的结构模板。使用的标准如序列同一性百分比、e值、链长度和查询覆盖率。该模型使用目标模板定位方法由SWISS模型构建。SAVES(结构分析和验证服务器)是集成的服务器用于验证模型(http://nihserver. mbi.ucla.edu/SAVES/)。使用PatchDock在p53和Mdm2之间进行分子对接，随后使用FireDock(http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/PatchDock/)细化结构。Patchdock是基于表面补丁匹配和具有快速搜索过滤和评分的更可靠的对接工具。它使用高级数据结构和空间搜索模式。它产生了几个结构后通过FireDock进一步过滤。使用Patch Dock计算两种配合物的对接得分和原子接触能(ACE)。

2结果与讨论

我们使用计算算法比较分析来自不同鱼的肿瘤抑制抗原p53。 p53已经在哺乳动物系统中与一些模式鱼一起被研究。在Q92143(月光鱼)和O57538(剑尾鱼)中大多数理化性质的值几乎相同，比如长度、理论pI、阳性R组、阴性R组和脂肪酸指数等(表2)。所有蛋白质的不稳定性指数的值高于40，表明所有9种蛋白质都是不稳定的。计算p53的消光系数(EC)值有助于蛋白质-配体和蛋白质-蛋白质相互作用的研究。Q9W679和Q9W678的pI值大于7，这表明两种蛋白质都是碱性的，其余蛋白质是酸性的。九种不同鱼类的所有p53蛋白质序列本质上是疏水性的。

多序列比对(MSA)可以深入了解几个物种的序列保守性，从而可以识别序列中对蛋白质功能最关键的部分(Jankun-Kelly et al., 2009)。此外，进行MSA，我们已经看到“MCNSSCMGGMNRR”是p53的所有九种不同蛋白质序列中的保守区(相同区域)，这表明该肽序列可以通过进化维持，而不是形态(图1)。我们对p53系统发育分析的研究揭示Q92143(月光鱼)O57538(剑尾鱼)彼此更接近。我们通过使用Scan Prosite已经感知到“MCNSSCMGGMNRR”基序的总共42个命中数(表3)(图2)。

蛋白质-蛋白质相互作用的研究是一个广泛的用来了解蛋白质组组织的方法。功能网络蛋白研究将有助于药物发现，理解代谢途径和预测或发展基因型-表型关联(Wang et al., 2009; Wang and Moult, 2001)。 为了了解p53蛋白的网络，我们使用STRING 9.1进行分析，并揭示功能节点-CHEK1，BCL2，MDM4在斑马鱼、青鳉和红木瓜狗头是常见的。mdm2和p53的相互作用在斑马鱼中分值较高。 蛋白质-蛋白质相互作用网络是系统水平上理解细胞过程的主要部分。我们已经通过逐个获得蛋白质研究了所有九个蛋白质序列-蛋白质相互作用网络。这里我们感兴趣的是知道哪些功能节点是p53网络中不同鱼类的共同特征。

我们已经揭示了蛋白质-蛋白质相互作用网络只有三种不同的鱼，即斑马鱼、青鳉和红木瓜狗头(表4,表5和表6)的p53和功能节点-CHEK1，BCL2，MDM2是常见的p53蛋白网络以及高置信度得分。 在STRING中，通过使用置信分数来分析功能性相互作用。得分<0.3的相互作用被认为是低置信度，得分范围为0.3~0.7为中等信度，得分>0.7为高置信度(Franceschini et al., 2013)。在斑马鱼中，p53蛋白网络显示与10个蛋白质的功能性关联，并且它们是Cdkn1a，Mdm2，atm，Chek1，bcl2，Mdm4，Wu：fa96e12，Chek2，LOC792573，Ep300a(图3)。

在交互网络中，在mdm2和p53之间没有黑线，这表明没有共表达。我们推测原因是所有10个蛋白质在斑马鱼、青鳉和红木瓜狗头中是保守的或者没有，并且还发现所有的节点都表示100％的序列保守性。4表示斑马鱼的发生结果。Mdm4和p53在斑马鱼、青鳉和红木瓜狗头中具有良好的高得分，这表明它们之间的强关联。其功能是通过结合其转录激活域来抑制p53和p73介导的细胞周期停滞和细胞凋亡。我们已经划分了p53的最好的前十个蛋白质-蛋白质相互作用网络(Lu et al., 2009; Oren, 1999; Wang et al., 2004)。

使用STRING工具发现Mdm2蛋白与斑马鱼p53蛋白有强关联。因此，为了研究结构层面的相互作用，我们已经完成了对接。首先，通过使用诸如PDB ID的同源结构进行同源性建模，从Swiss-Model获得的斑马鱼的p53的3D结构;，3Q05_A, 3Q01_A, 3Q06_A, 4MZR_A分别具有58,57,58,57%的相似度。所获得的3D结构用SAVES服务器验证(图4)。 使用PatchDock在p53和Mdm2之间进行分子对接，随后使用FireDock细化结构。使用Patch DockBoth计算两个配合物的对接得分和原子接触能(ACE)。PDB结构用于对接分析(图4)。 p53和Mdm2之间的对接揭示它们分别需要全球能量10.57和ACE 0.18。

3结论

本研究是第一次对鱼类中肿瘤抑制抗原p53比较全面的研究。在本研究中，我们已经研究了大多数理化性质在Q92143(月光鱼)和O57538(剑尾鱼)中几乎相同。在进行比对后，我们已经看到“MCNSSCMGGMNRR”是存在于p53的所有9个蛋白质序列中的保守(相同)基序，并且共预测到来自数据库的42命中数，其指示了该区域的重要性。从蛋白质-蛋白质相互作用网络研究中我们已经看到功能节点-CHEK1，BCL2，MDM4在斑马鱼、青鳉和红木瓜狗头三个物种p53蛋白网络中是常见的，并且具有高置信分数。此外，这种肿瘤抑制p53的蛋白质-蛋白质相互作用途径帮助我们了解各种细胞途径中的作用和相关的蛋白质。对接研究还证实p53与具有全球能量的mdm2相互作用。因此，目前的工作将为了解不同物种包括鱼的tp53蛋白提供了更多的支持(图5)。

作者贡献

SK和KDR对研究计划和程序进行设计；SK，KDR，PJ，JKS和SN分析数据并撰写初稿。所有作者都阅读并同意最终文本。

致谢

我们感谢印度新德里农业研究理事会对本研究的支持。

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